樣品中強保留物質逐漸在色譜柱中積累造成高效液相色譜儀色譜柱的污染，情況嚴重的直接造成色譜柱報廢。

為延長色譜柱的使用壽命，常用到的方法是色譜柱保護與再生。

高效液相色譜儀色譜柱在色譜分析系統(tǒng)中主要起著分離檢測物質的作用，如同色譜系統(tǒng)的心臟，同時也是易損耗品。

色譜柱在吸附樣品時，樣品中所含有的鹽、脂質、疏水蛋白質和其它一些生物物質都有可能與色譜柱發(fā)生相互作用，一些保留值較小的物質如鹽類比較容易被沖出色譜柱，而一些保留性較強的組分，流動相溶液不足以把這些物質洗脫下來，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質通常就會積累在柱頭。

當這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使之形成新的固定相而改變分離機理，以致樣品保留時間會波動，會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

色譜柱結構 1-塑料保護堵頭；2-柱頭螺絲；3-刃環(huán)(卡套)；4-聚四氟乙烯O形圈；5-多孔不銹鋼燒結片；6-色譜柱管；7-液相色譜固定相

色譜柱保護

為了延長色譜柱的使用壽命，前面已經(jīng)指出，應在分析柱前連接一個小體積的保護柱。保護柱是內徑為1.0mm、2.1mm、3.2mm、4.6mm或10mm、20mm、40mm，長7.5mm、10mm或20～60mm的短填充柱，通常填充和分析柱相同的填料(固定相)，可看作是分析柱的縮短形式，安裝在分析柱前。

其作用是收集、阻斷來自進樣器的機械和化學雜質，以保護和延長分析柱的使用壽命。一只1cm長的保護柱就能提供充分的保護作用。若選用較長的保護柱，可降低污染物進入分析柱的機會，但會引起譜帶擴張。因此選擇保護柱的原則是在滿足分離要求的前提下，盡可能選擇對分離樣品保留低的短保護柱。

保護柱也可裝填和分析柱不同的填料，如較粗顆粒的硅膠(10～15um)或聚合物填料，但柱體積不宜過大，以降低柱外效應的影響。

保護柱裝填的填料較少，價格較低，其為消耗品，通常可分析50～100次樣品，柱壓力降呈現(xiàn)增大的趨向就是需要更換保護柱的信號。

現(xiàn)在市場供應的結構新穎可更換柱芯式設計的保護柱，由保護柱套和可更換式保護柱芯兩部分組成。

保護柱與分析柱的連接示意圖

1-保護柱套；2-保護柱芯；3-PEEK標準通用接頭；4-分析柱接頭；5-連接六通進樣閥接頭

對硅膠基體的鍵合固定相，流動相的pH值應保持在2.5～7.0之間。具有極端值的流動相會溶解硅膠，而使鍵合相流失。

使用水溶性流動相時，為防止微生物繁殖引起柱阻塞，應加入0.01％的疊氮化鈉，以抑制微生物的繁殖。對不潔凈的樣品，要使用0.45um濾膜過濾或經(jīng)固相萃取器凈化后再進樣。

進行正式分析前，應先用10倍柱體積的流動相沖洗色譜柱，以保持色譜柱處于平衡狀態(tài)。當使用乙醇、異丙醇、乙酸等黏度大的流動相時，色譜柱的平衡時間要延長，甚至要加倍。

對反相C18 鍵合相柱，除去柱中含有的緩沖溶液鹽類或水溶性物質時，不應使用純水沖洗。因為C18鍵合相像一條長鏈將硅膠黏結，當有有機溶劑存在時，其表面被流動相潤濕，C18長鏈完全展開，像海水中的海藻一樣。當純水或緩沖溶液通過時，C18鍵合相與其不浸潤，鍵合相表面會塌陷，從而將溶劑、樣品分子或無機鹽分子包合。此時僅用純水無法將包合物洗脫出，應使用含5％有機溶劑的水溶液沖洗，才可清除無機鹽或水溶性物質。

硅膠、氧化鋁或正相鍵合相柱，應保存在流動相中。氰基柱不能保存在純有機溶劑(如甲醇或乙腈)中，應保留在欲使用的流動相中；氨基柱最好保存在乙腈中，而非流動相，并且應注意不可使用丙酮作流動相。C18反相柱應保存在純甲醇溶劑中，對填充高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚微球的非極性固定相也可用此法保存。

色譜柱再生

對使用時間較長、柱效逐漸下降的色譜柱，可用下述方法進行快速再生，以除去微量不潔雜質在柱頭的聚積。

正相柱：用下述極性強且能互溶的有機溶劑來洗滌色譜柱，每種溶劑每次用30mL清洗，按庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮(氨基柱不用)、甲醇、5％甲醇水溶液次序沖洗(洗脫劑的極性依次遞增)，最后再用純甲醇通過柱將水分帶出，拆下柱置于氣相色譜儀柱箱中升溫至75℃，以除去水分。另應注意不能使用乙醇，它會使柱喪失柱效。

反相柱：用極性溶劑每種30mL，按以下順序清洗：5％甲醇水溶液、0.5mol/L H3PO4(或0.1mol/L EDTA鈉鹽)、5％甲醇水溶液、甲醇、甲醇-氯仿(1：1)混合液、甲醇、5％甲醇水溶液。最后保存在甲醇溶劑中。

當色譜柱的性能變得很差時，可采用下述兩種方法，作最后的補救。

一種方法是修補柱頭并同時更換不銹鋼燒結片。當取下燒結片發(fā)現(xiàn)柱頭塌陷或填料被雜質污染時，可挖掉0.5mm左右的固定相，再重新填充同樣的干燥固定相，用少量流動相潤濕，再填充干燥的固定相與柱口平齊(必要時用光滑的不銹鋼棒壓緊)，如此重復3～5次。

再換上新的不銹鋼燒結過濾片，擰緊結頭，與高壓泵連接，用流動相沖洗20min，若柱壓力降恢復正常，可連接檢測器，測柱效。若柱效恢復就可繼續(xù)使用。若柱壓力降恢復正常，但柱效仍偏低，表明柱頭未填充緊密，仍有空隙，此時應重復上述操作，直至柱壓力降恢復正常、柱效也恢復正常才可繼續(xù)使用。

另一種方法是倒沖色譜柱。此法適用于已修補過柱頭，柱壽命已達中后期的色譜柱。柱逆向使用后柱效會損失較大(約30％)，倒沖柱可檢查柱頭不銹鋼燒結片是否堵塞。若已堵塞在倒沖柱時，可觀察到柱壓力降減小，待柱壓力降恢復正常，再將色譜柱按原方向安裝使用。

柱的使用和維護注意事項

色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。 1、避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。 2、應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然，流動相使用前必須?jīng)脫氣和過濾處理。 3、一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。 4、選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質被溶解，壓力升高是需要更換預柱的信號。 5、避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處 理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。 6、經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50～75ml。

7、避免使用高粘度的溶劑作為流動相；如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應在實驗完畢柱子沖洗干凈。8、進樣樣品要提純； 9、嚴格控制進樣量，不要超載。 10、每天分析測定結束后，都要用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗詈糜孟疵撃芰姷南疵撘簺_洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應每隔4~5天開機沖洗15分鐘。 11、大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍。 12、按說明書保存色譜柱，絕對禁止講緩沖液留在柱內過夜，注意反相柱不能用純水長時間沖。 13、不建議拆開柱子，自己更換填料。