總體策略 → 樣品前處理 → 分離手段選擇 → 色譜條件開發(fā) → 分級(jí)/制備放大 → 鑒定與定量 → 方法驗(yàn)證與質(zhì)量控制 → 常見問題與解決”來組織，便于在實(shí)際實(shí)驗(yàn)室中操作與決策。

一、總體策略（先明確目標(biāo)）

明確研究目的：定性（成分鑒定）、定量（指標(biāo)成分含量）、指紋圖譜、分離純化（制備）或活性導(dǎo)向分離。

明確目標(biāo)化合物類別（生物堿、黃酮、皂苷、苷類、揮發(fā)油、多糖等）及其理化特性：極性、酸堿性、揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性、紫外吸收/電離能力。

依據(jù)目標(biāo)和樣品基質(zhì)制定分離路線：先“粗分級(jí)（溶劑分配/液液分配/SPE）→ 中間分離（柱色譜/開柱、CC）→ 精制（制備HPLC/CCC）→ 鑒定（LC-MS, NMR）”。

二、樣品前處理（關(guān)鍵，影響后續(xù)分離）

原料粉碎并過篩，記錄批次；控制水分避免發(fā)霉。

提取選擇：依據(jù)目標(biāo)化合物極性選溶劑（揮發(fā)油：蒸餾或有機(jī)溶劑/SPME；中等極性成分：70%MeOH、EtOH；極極性：水或水提）；可先做小規(guī)模單因素試驗(yàn)比較提取率。

粗提/分級(jí)：經(jīng)常使用溶劑漸進(jìn)提取或溶劑分配（如水提后用石油醚/乙酸乙酯/n-BuOH分層）把樣物按極性分級(jí)，簡(jiǎn)化后續(xù)工作量。

去除脂溶雜質(zhì)：若含蠟/脂多，先用石油醚或正己烷脫脂。

固相萃?。⊿PE）：用于濃縮、去鹽或去色素，選擇C18、Si、PS-DVB、SCX/SAX等吸附劑按需。

過濾與稀釋：進(jìn)樣前0.22–0.45 μm膜過濾，溶劑與流動(dòng)相匹配（避免溶劑強(qiáng)度過高導(dǎo)致峰形差）。

三、分離手段選擇（按目標(biāo)物理化學(xué)性質(zhì)）

非揮發(fā)性小分子（黃酮、苷類、生物堿、皂苷等）：首選反相HPLC/UPLC（C18/C8）；對(duì)高度極性者可選HILIC；對(duì)強(qiáng)極性或高分子選離子色譜或尺寸排阻（SEC/HPGPC）。

揮發(fā)性成分（揮發(fā)油、萜類）：GC 或 GC-MS（前處理：蒸餾、SPME、溶劑萃取）。

強(qiáng)極性/無紫外吸收（多糖、極性寡糖）：HPGPC、離子交換或衍生化后用RP-HPLC；多糖用酶或色譜-化學(xué)法。

制備分離：中試/制備HPLC、逆流色譜（CPC/HPCCC）、硅膠柱色譜、Flash色譜等。逆流色譜對(duì)極性差異小的天然產(chǎn)物非常有效。

四、分析條件開發(fā)（以HPLC/UPLC為主）

固定相選擇

C18（通用首選），C8（較少保留）、Phenyl（芳香相互作用）、CN/Amide（弱極性或極性互補(bǔ)）、HILIC（強(qiáng)極性）。

流動(dòng)相與pH控制

常用：乙腈-水或甲醇-水。為改善峰形、提高離子化或穩(wěn)定性，加入揮發(fā)性酸/鹽（0.1%甲酸或乙酸、10 mM 甲酸銨/乙酸銨、5–20 mM 乙酸銨/碳酸銨）；用于堿性生物堿可加少量堿（0.01–0.05%三乙胺或碳酸氨），但對(duì)MS需選揮發(fā)性緩沖。pH對(duì)離子化化合物影響大，pH調(diào)節(jié)能顯著改變保留。

起始條件建議（常用分析柱 4.6×150 mm，5 μm）

黃酮/苷類：ACN/水 + 0.1%甲酸，梯度 5% → 60% ACN（30 min），流速 1.0 mL/min，λ 254/280 nm。

生物堿（堿性）: ACN/10 mM NH4HCO3 (pH ~9) 或 ACN/0.05% TEA（調(diào)整使堿性化合物呈中性或弱離子化），梯度 5%→60%（30 min），用UV或MS檢測(cè)。

皂苷（無強(qiáng)紫外）：MeOH/H2O 或 ACN/H2O，檢測(cè)用ELSD/CAD或MS；梯度 20%→90% ACN/MeOH（視樣品）。

多糖/極性小分子：HILIC（ACN高比例）或衍生后RP-HPLC。

檢測(cè)器

紫外/二極管陣列（DAD）：適合含共軛系統(tǒng)的化合物。

ELSD/CAD：適合無或弱UV吸收的皂苷、三萜類。

LC-MS/MS：用于跟蹤、鑒定和痕量定量（選擇正/負(fù)離子模式）。

方法開發(fā)流程（快速迭代）

先做試劑/溶劑相容性與柱選擇的 scouting（小樣色譜圖比較不同柱）。

選一兩種候選柱（C18、Phenyl、HILIC），用梯度掃描（短梯度如5→95% ACN 0–20 min）觀察成分分布。

優(yōu)化梯度坡度、起始/終止有機(jī)相、流速、柱溫與pH以改善關(guān)鍵峰分離。

小心樣品溶劑強(qiáng)度對(duì)峰形的影響，必要時(shí)換溶劑或降低注入體積。

系統(tǒng)適用性指標(biāo)（SST）

理論板數(shù)、尾峰因子、重復(fù)進(jìn)樣RSD、分辨率（關(guān)鍵組分Rs>1.5）作為放行標(biāo)準(zhǔn)。

五、分級(jí)與制備放大策略

先用溶劑分配/液-liquid提取減低復(fù)雜度（可按極性連續(xù)分配：石油醚→乙酸乙酯→n-BuOH）。

對(duì)中等純度制備：硅膠柱/ODS開柱分離 → 收集粗分餾（按薄層/分析HPLC監(jiān)測(cè)）。

需要較高純度：用制備HPLC或CPC/HPCCC（避免固定相吸附，適合洋蔥式分離）。

放大注意：放大不是線性按體積縮放（需按填料質(zhì)量、表面積、線速度和載樣量重建條件）；對(duì)放大建議做中等放大試驗(yàn)再全放大。

六、鑒定與定量

鑒定：LC-MS/MS（分子量、片段）、NMR（結(jié)構(gòu)確認(rèn)）、UV/IR 輔助。對(duì)未知峰，盡量獲得高分辨率MS與MS/MS。

定量：用外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法；對(duì)復(fù)雜基質(zhì)建議用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線或標(biāo)準(zhǔn)加入法校正矩陣效應(yīng)。

指紋/多成分定量：建立指紋圖譜并挑選若干指示峰作為質(zhì)量控制（符合連續(xù)批次相似度）。

七、方法驗(yàn)證（參照ICH與藥典） 必須評(píng)估：特異性/選擇性、線性、準(zhǔn)確度（回收率）、精密度（重復(fù)性/中間精密）、LOD/LOQ、穩(wěn)定性、魯棒性/范圍。對(duì)LC-MS還需評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)與離子抑制。給出典型閾值：回收率 90–110%（可根據(jù)目標(biāo)調(diào)整），RSD ≤2–5%（含量測(cè)定通常 ≤2%）。

八、常見問題與解決

峰拖尾：檢查pH（弱酸/堿被吸附）、使用競(jìng)爭(zhēng)性洗脫劑、改用端胺化或低殘留硅膠柱、減少硅膠上羥基暴露（用TEA微堿或甲酸銨）。

峰分裂/寬峰：樣品溶劑太強(qiáng)、注入體積過大、體系外體積大（窄徑柱注意最小死體積）、柱污染。

分辨率不足：改變梯度斜率、降低流速提高理論板、換柱（更高效或不同選擇性）。

基線噪聲/漂移（ELSD/CAD）：流動(dòng)相揮發(fā)性不一致或泵不穩(wěn)定；對(duì)LC-MS基線噪聲檢查溶劑純度與脫氣。

含鹽/基質(zhì)抑制LC-MS：用SPE或稀釋、改用其他離子化模式（APCI）、優(yōu)化洗脫梯度減少基質(zhì)共洗脫。

目標(biāo)峰無UV吸收：改用ELSD/CAD或MS檢測(cè)，或化學(xué)衍生化賦予紫外/熒光性質(zhì)。

九、質(zhì)量控制與記錄

建立樣品前處理 SOP、色譜方法 SOP、系統(tǒng)適用性測(cè)試 SOP。

保存原始色譜數(shù)據(jù)、樣品制備記錄、對(duì)照品批次與純度證明。

對(duì)于常規(guī)質(zhì)量控制可建立快速指紋或多指標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定流程。

十、實(shí)用模板（示例起始條件）

黃酮/苷類分析（分析柱 4.6×150 mm, 5 μm）： 流動(dòng)相 A：水 + 0.1% 甲酸；B：乙腈

梯度：5% B（0–2 min）→ 40% B（2–25 min）→ 95% B（25–28 min）→ 5% B 回平衡（28–35 min）

流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)：DAD 254/280 nm。

生物堿分析（堿性）： A：10 mM NH4HCO3 (pH ~9)；B：乙腈

梯度 5→60% B（0–30 min），流速 1.0 mL/min，檢測(cè) UV 或 MS（正離子模式）。

皂苷制備（ELSD/制備HPLC）： A：水；B：甲醇/乙腈混合（1:1）或純MeOH

梯度 20→90% B（0–40 min），檢測(cè) ELSD，制備柱按填料放大。