|
一、核心原則與簡(jiǎn)單公式 列體積(柱容積)Vc = π d^2 L / 4(d、L 單位 mm;得到的體積為 μL); 常用經(jīng)驗(yàn):分析柱的安全進(jìn)樣體積通常按柱體積的百分比來(lái)限制: 保守推薦:0.1%–0.5%(用于溶劑強(qiáng)度高、窄峰要求高或窄內(nèi)徑柱); 常用范圍:0.5%–2%(多數(shù)常規(guī) 4.6 mm 分析條件); 寬松上限:2%–5%(若溶劑與起始流動(dòng)相匹配且需較高靈敏度,可在驗(yàn)證后適當(dāng)放寬); 注:這些百分比是體積比例,不考慮樣品溶劑強(qiáng)度與固定相載樣量。 二、為什么要限制進(jìn)樣體積(主要限制因素) 溶劑效應(yīng)(樣品溶劑比起始流動(dòng)相“更強(qiáng)”會(huì)導(dǎo)致前淌峰或峰形展寬):強(qiáng)溶劑大體積注入最容易導(dǎo)致峰形劣化; 固定相載樣量有限:樣品質(zhì)量過(guò)大會(huì)造成吸附位點(diǎn)飽和,引起峰拖尾/分裂和分辨率下降; 體系外體積(extra-column volume):對(duì)窄內(nèi)徑柱影響更大,會(huì)造成峰變寬,降低有效分離能力; 檢測(cè)器飽和:高濃度或大量進(jìn)樣導(dǎo)致 UV / MS / ELSD 飽和影響定量線性; 自動(dòng)進(jìn)樣器/注射環(huán)精度與最小可準(zhǔn)確體積限制(尤其 μL 以下); 背壓與流速(對(duì)微柱/微流路操作時(shí)連線和泵的物理限制)。 三、計(jì)算與示例(常用柱) 用上面公式先算柱體積,再取推薦百分比: 4.6×150 mm:Vc ≈ 2493 μL → 0.5% ≈ 12.5 μL,1% ≈ 25 μL(常用 5–20 μL) 4.6×100 mm:Vc ≈ 1662 μL → 0.5% ≈ 8.3 μL,1% ≈ 16.6 μL 4.6×50 mm:Vc ≈ 831 μL → 0.5% ≈ 4.2 μL 3.0×150 mm:Vc ≈ 1059 μL → 0.5% ≈ 5.3 μL 2.1×100 mm:Vc ≈ 346 μL → 0.5% ≈ 1.7 μL,1% ≈ 3.5 μL(常用 0.5–5 μL) 1.0×150 mm:Vc ≈ 118 μL → 0.5% ≈ 0.6 μL(微流/納升級(jí)通常為 nL–μL 級(jí)) 四、樣品溶劑強(qiáng)度對(duì)進(jìn)樣體積的影響(關(guān)鍵) 若樣品溶劑“比起始流動(dòng)相弱”(更接近水相、低有機(jī)相),可安全注入較大體積; 若樣品溶劑“比起始流動(dòng)相強(qiáng)”(如高 % 有機(jī)在低 % 有機(jī)起始梯度),即使體積很小也會(huì)造成前淌峰。經(jīng)驗(yàn)規(guī)則:當(dāng)樣品溶劑強(qiáng)于起始流動(dòng)相時(shí),進(jìn)樣體積應(yīng)顯著減?。ㄍǔ?≤0.5% 柱容),或用在線富集/trap柱/保留間隙法處理; 梯度和等度的差別:梯度起始為弱溶劑時(shí)可用稍大體積(因?yàn)樘荻取皦嚎s”峰),等度時(shí)更敏感。 五、如何判定是否過(guò)載或進(jìn)樣過(guò)多(現(xiàn)象) 峰寬顯著增大、對(duì)稱性差(尾峰或前峰)、分辨率下降; 保留時(shí)間出現(xiàn)漂移或變短(早期淌峰); 檢測(cè)器響應(yīng)非線性或飽和(高濃度情況下特別明顯); 重復(fù)進(jìn)樣精密度變差。 六、放大或需要大體積進(jìn)樣時(shí)的策略 稀釋樣品降低溶劑強(qiáng)度,與起始流動(dòng)相匹配; 改用更大內(nèi)徑或更長(zhǎng)柱(提高柱容)或制備柱; 使用在線富集/trap柱(把大量樣品先保留在 trap 上,用小體積沖洗后快速切換到分析柱); 固相萃取(SPE)或前處理濃縮,去除基體并把樣品換到弱溶劑中; 大體積進(jìn)樣技術(shù)(LVI):分程注入、樣品溶劑揮發(fā)(蒸干重溶)或保留間隙(retention gap)——多用于 GC/LC 的專用方法,需驗(yàn)證; 減少系統(tǒng)外體積、使用低死體積接頭和短連線,尤其在窄內(nèi)徑柱時(shí)。 七、實(shí)用建議(方法開發(fā)時(shí)的檢查清單) 先根據(jù)柱體積算出 0.5% 與 1% 的體積,作為起始試驗(yàn)值; 檢驗(yàn)樣品溶劑與起始流動(dòng)相的匹配度:若不匹配,先做稀釋或換溶劑,或把注入體積減為 0.1–0.2% 再觀察; 在優(yōu)化時(shí)做注入量梯度(例如 0.1%、0.5%、1%、2%)觀察峰形與線性,確定最大允許體積與線性范圍; 窄徑(2.1 mm 及以下)和 UPLC 列務(wù)必盡量小體積進(jìn)樣并最小化外部死體積; 對(duì)定量方法在驗(yàn)證階段明確進(jìn)樣體積、線性范圍與檢測(cè)器飽和點(diǎn),并寫入 SOP。 |
- 上一篇:中藥提取物的分離方法建立
- 下一篇:液相色譜柱有進(jìn)樣體積的限制嗎?


