溫度的影響 - 蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南

柱溫和流動相溫度會以兩種方式影響多肽的分離。
隨著溫度上升，保留值會略微降低。
但更重要的是，肽對的相對保留值（選擇性）取決于溫度。
選擇性隨溫度的變化影響分辨率，且在一系列多肽分離的優(yōu)化中，溫度是重要因素，如蛋白酶水解蛋白質期間產(chǎn)生的多肽。
溫度在一系列合成肽分離中的作用如圖23所示。
隨著溫度的增加，多肽保留值略有下降，但更重要的是，肽對間的分辨率隨著溫度的變化而變化。

因此，在多肽的分離中，控制柱溫和流動相溫度很重要。
此外，溫度還是肽分離優(yōu)化的重要變量，尤其是肽圖譜中的分離。

溫度會顯著影響肽圖譜中多肽的分離，如圖24所示。
該示例為從人生長激素的胰蛋白酶水解物中分離多肽，增加柱溫不僅影響肽的選擇性，還會造成洗脫順序的逆轉。肽7和8在較高溫度下的分辨率更高。
肽11~13的最佳分離溫度為40°C，溫度提升至60℃會出現(xiàn)肽11和12的共洗脫峰。
肽14和15的最適分離溫度為20°C，肽15先出峰。
溫度升至40℃時會使肽14先于肽15洗脫。
溫度升至60℃時會提高肽14和15的分辨率。
在肽圖譜中可以明顯看出柱溫對分辨率有顯著的影響。

圖23. 多肽保留值隨著溫度的增加而降低。更重要的是，溫度影響相對保留值或選擇性，進而影響分辨率。

條件

色譜柱：C8，2.1 x 150 mm

流動相：0~30% 乙腈—0.05% TFA體系，梯度洗脫，60分鐘。

樣品：合成螺旋多肽和非螺旋多肽

圖24. 通常，蛋白水解產(chǎn)生多肽的相對保留值會受到溫度的影響。

條件

色譜柱：C8寬孔柱，4.6 x 150 mm

流動相：0~60% 乙腈—0.1% TFA體系，混合梯度洗脫，60分鐘。

樣品：人生長激素的胰蛋白酶水解物

與多肽分辨率相比，蛋白質分辨率受溫度的影響較小，但溫度較高時，蛋白質的峰形和回收率均有所改善，特別是大分子蛋白或疏水性蛋白。
在環(huán)境溫度下，單克隆抗體圖譜的峰形較差，但當溫度升高時，峰形會有明顯改善（圖25）。
通常在高溫下用色譜法分析大分子蛋白或疏水性蛋白的效果最佳。

圖25.溫度對反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分析重組單克隆抗體的影響。

條件

色譜柱：C8 寬孔柱，3.5 微米，4.6 x 150 mm

流動相：混合液梯度洗脫：20-90% 乙腈-0.1% TFA體系

樣品：重組單克隆抗體